A. Pendahuluan
Pembiakan dan identifikasi bakteri
bersumber dari spesimen yang merupakan hasil proses infeksi, sedangkan infeksi
itu sendiri dapat berasal dari berbagai sumber,beberapa tahapan terjadinya
proses infeksi :
§ Infeksi
memerlukan tempat masuk yang sesuai (port of entry) misalnya saluran
pernafasan, saluran pencernaan, kontak langsung, gigitan serangga.
§ Tempat
masuknya bakteri biasanya spesifik terutama untuk bakteri patogen, bakteri
harus tumbuh dan berkembang dalam tubuh hospes dan menyebar melalui system
limfa dan aliran darah menyebar ke seluruh jaringan,
§ Penyebaran
infeksi memerlukan jalan keluar unuk menginfeksi hospes lainnya (port of
exit). .
Istilah mikroorganisme yang biasanya
merupakan penyebab penyakit disebut patogen dan patogenitas adalah kemampuan
mikroorganisme menyebabkan sakit.Virulensi berhubungan dengan derajat
patogenitas bakteri. Patogenitas dan virulensi berkaitan dengan
penyebaran atau toksigenitas. Penyebaran artinya kemampuan bakteri untuk
masuk untuk masuk , menyebar dam berkembangbiak di dalam jaringan hospes.
Toksigenitas berhubungan dengan kemampuan bakteri menghasilkan toksin.Virulensi
dinyatakan dengan LD50 yaitu konsentrasi mikroorganisme yang
menyebabkan 50 persen hewan percobaan sakit. Proses ketika mikroorganisme
patogen masuk dikenal dengan infeksi, selama proses ini hospes dapat menjadi
sakit, infeksi terselubung atau sehat menjadi karier
Aspek
patogenitas bakteri
Patogenitas
bakteri terutama disebabkan oleh adanya kapsul pada bakteri tersebut, bakteri
yang tidak berkapsul lebih mudah untuk difagosit oleh sel leukosit. Hilangnya
kapsul bakteri berhubungan dengan hilangnya virulensi bakteri karena
kapsul diketahui sebagai faktor pengganggu. (contohnyaPneumococcus)
Toksin
bakteri
Toksin bakteri diketahui memiliki
peranan penting dalam kemampuan bakteri menimbulkan penyakit. Toksin
dibagi dalam kelompok eksotoksin dan endotoksin.
a.
Eksotoksin
Eksotoksin di hasilkan oleh bakteri
ke lingkungan dan potensial serta spesifik untuk jaringan hospes,
kemampuan menghasilkan eksotoksin biasanya pada bakteri gram positif batang
seperti Clostridium dan Corynebacterium. Eksotoksin merupakan
antigen kuat, tidak tahan panas, merupakan substansi protein, hancur oleh enzim
proteolitik kecuali Clostridium botulinum, efek toksin dapat
hancur oleh formalin, panas dan penyimpanan yang lama tetapi tidak untuk sifat
antigeniknya, contohnya toxoid untuk program imunisasi
b.
Endotoksin.
Endotoksin
ditemukan intraseluler, terdapat pada dinding sel bakteri dan toksin ini
dilepaskan oleh bakteri setelah bakteri hancur, endotoksin biasanya berhubungan
dengan bakteri gram negatif dan bersifat antigen lemah. Endotoksin bersifat tahan terhadap panas, polisakaridanya
tidak dapat dicerna oleh enzim proteolitik, endotoksin bersifat toksin lemah
dan menginduksi reaksi demam pada hospes dan dapat menyebabkan syok
Enzim ekstraseluler
Beberapa mikroorganisme memproduksi
enzim ekstraseluler yang ikut berperan dalam patogenitas, enzim tersebut
adalah:
a. Enzim koagulase, berhubungan dengan
patogenitas Staphylococcus. Uji koagulase dilakukan
menggunakan plasma menyebabkan terjadinya koagulasi.
b. Kolagenase adalah enzim yang dibentuk oleh Clostridium,
bersifat dapat menghancurkan kolagen sehingga menyebabkan bakteri menyebar ke
jaringan
c. Hialuronidase adalah enzim yang
diketahui sebagai faktor penyebaran bakteri. Enzim ini diproduksi oleh Staphylococcus,
Clostridium, Streptococcus dan Pneumococcus.
d. Streptokinase dikenal pula sebagai enzim fibrinolisin,
diproduksi oleh Streptococcus, Staphylococcus, dan Clostridium
perfringens. Streptokinase merupakan enzim proteolitik plasma yang disebut
plasmin, plasmin dapat melarutkan plasma yang terkoagulasi dan aktifitas
tersebut memungkinkan bakteri menyebar
e. Hemolisin merupakan kelompok
substansi terlarut yang diproduksi oleh Staphylococcus, Pneumococcus,
beberapa Clostridium, dan Steptococcus, hemolisin bersifat
merusak jaringan. Streptolisin memiliki kemampuan melisiskan eritrosit.
f.
Leukosidin dalah substansi yang
merusak leukosit, mereka diproduksi oleh streptococcus dan staphylococcus
Bakteri
berdasarkan kebutuhan energi, dibagi dalam dua kelompok, yaitu
Ø Bakteri
autotrof
Bakteri
autotrof memperoleh energi dan tumbuh pada media anorganik, membutuhkan
karbondioksida sebagai sumber karbon.
Ø Bakteri
heterotrof
Bakteri
heterotrof mendapatkan energi dari sumber karbon organik. Bakteri heterotrof
membutuhkan penambahan gula, asam amino, purin, pirimidin dan vitamin pada
media kultur. Fermentasi gula merupakan sumber energi utama.
Morfologi bakteri.
Ukuran
bakteri coccus berdiameter 1
micron (μ), bakteri batang memiliki lebar 0.5 μ dan panjang of 2 μ, sedangkan
spirochaeta berbentuk ulir dengan lebar 0.2 μ dan lebar 10 μ.
Bentuk-bentuk bakteri:
Struktur bakteri
Struktur
umum bakteri terdiri dari
Ø Dinding
sel
Ø Membrane
sitoplasma
Ø Sitoplasma
Ø Inti
Struktur
khusus bakteri:
Ø Kapsul,
merupakan substansi eksretori, sebagai benteng pertahanan melawan fagositosis
oleh sel darah putih dan penetrasi virus
Ø Flagel,
berasal dari protein elastin yang berada di sitoplasma dan keluar badan bakteri
berfungsi sebagai organ pergerakan
Ø Spora,
bentuk vegetatif bakteri untuk bertahan pada lingkungan yang kurang
menguntungkan
Ø Inclusion
bodies, vakuola yang berfungsi sebagai tempat sisa material di sitoplasma
B. Isolasi dan identifikasi
Pengertian
Di alam populasi mikroba tidak
terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran
berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi
menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari
morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.
Ketika
spesimen datang ke laboratorium harus dilihat terlebih dahulu keadaan spesimen
apakah memenuhi persyaratan spesimen misalnya cara pengiriman sampel apakah
telah sesuai dengan jenis pemeriksaan, apakah mencukupi untuk jumlah
pemeriksaan yang diminta atau misalnya untuk spesimen sputum apakah benar
sputum atau saliva. Ketika spesimen datang jenisnya bermacam-macam datang
bersamaan harus diprioritaskan yang lebih mendesak untuk dilakukan pemeriksaan
terlebih dahulu, misalnya CSF, jaringan, darah dan cairan tubuh yang steril.
Urine, swab tenggorok, sputum, feses atau apus luka dapat ditunda
pemeriksaannya berikutnya .spesimen virus dan jamur biasanya satu kali
pemeriksaan untuk satu spesimen, jadi perlu dipertimbangkan jumlah spesimen
apakah mencukupi untuk pemeriksaan yang lain. Selain itu juga diperlukan
pengamatan spesimen secara umum misalnya apakah mengandung darah, keruh atau
membeku dan harus dibuat catatan secara tertulis.
1. Pemeriksaan
mikroskopis
Pemeriksaan
mikroskopis dilakukan pada semua spesimen yang datang. Pemeriksaan bertujuan
misalnya pada sputum apabila telah dilakukan pemeriksaan mikroskopis
didapatkan perhitungan sel darah putih dan epitel skuamosa merupakan
petanda spesimen bukan dari saluran nafas bagian bawah. Misalnya untuk isolasi dan
identifikasi bakteri dengan pembuatan apusan dari spesimen langsung kemudian
dilakukan pewarnaan Gram untuk mengetahui sifat, bentuk bakteri, eritrosit, sel
leukosit atau sel epitel skuamosa dan memberikan arahan untuk pemilihan
media perbenihan yang sesuai untuk isolasi dan identifikasi. Yang
dilaporkan dari hasil pewarnaan Gram yaitu:
a)
Reaksi terhadap Gram
(positif/negatif)
b)
Morfologi (kokus, batang, koma,
kokobasil, koma atau spiral
c)
Susunan (sendiri-sendiri, dua-dua,
berantai, berkelompok/seperti anggur, sarkina)
Selain
pewarnaan Gram untuk pemeriksaan jamur secara langsung yang biasa
digunakan yaitu pemeriksaan dengan KOH , periodic acid Schiff (PAS)
atau calcoflour white
2. Pemilihan
media perbenihan
Media perbenihan
Media perbenihan mikroorganisme
adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang
diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan
nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen
sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroorganisme menjadi
kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya sesuai
kebutuhan bakteri. Oleh karena bakteri yang berbeda memerlukan kebutuhan akan
nutrisi yang berbeda pula , sehingga dikembangkan berbagai macam media
perbenihan untuk digunakan dalam diagnosa mikrobiologi.
Media perbenihan terdiri dari dua bentuk yaitu bentuk cair dan padat (agar).
Pada media cair, bahan-bahan gizi dilarutkan dalam air sehingga
pertumbuhan bakteri ditandai dengan perubahan warna media menjadi keruh,
semakin banyak bakteri tumbuh akan semakin keruh larutan. Diperlukan jumlah
bakteri 106 sehingga dapat terlihat adanya pertumbuhan tanpa
mikroskop.
Media padat dibuat dengan
penambahan bahan pengeras pada campuran bahan gizi dan air. Biasanya
digunakan agar yang memiliki sifat cair pada suhu ≥ 95⁰C tetapi berbentuk padat pada suhu
dibawah 50⁰C.Dengan kondisi inkubasi yang
sesuai bakteri dapat tumbuh dan berkembang dalam jumlah yang banyak sehingga
dapat dilihat tanpa menggunakan mikroskop. Pertumbuhan bakteri membentuk
kelompok yang terdiri dari satu jenis bakteri yang disebut koloni, dengan kata
lain dalam satu koloni adalah bakteri yang sama genus dan spesiesnya
memiliki karakteristik gen dan fenotip yang sama. Pembiakan bakteri yang
terdiri dari satu macam koloni yang seragam disebut dengan pembiakan murni.
Pembiakan yang murni diperlukan untuk identifikasi bakteri, untuk
memudahkan pengambilan koloni yang sama ketika ditanam pada media identifikasi.
Lingkungan yang dibutuhkan untuk
pertumbuhan mikroba
Kondisi
lingkungan yang optimal akan mendukung pertumbuhan bakteri pada media
pembiakan, empat faktor lingkuangan yang paling penting, yaitu:
a)
Tersedianya oksigen atau
karbondioksida
Kebanyakan bakteri klinik adalah terdiri dari bakteri aerob,
anaerob fakultatif atau anaerob obligat.Bakteri aerob adalah bakteri yang
menggunakan oksigen sebagai reseptor elektron.Bakteri anaerob fakultatif dapat
tumbuh pada kondisi aerob dan anaerob.Tetapi untuk bakteri seperti Pseudomonas
spp, Neisseria spp, Bordetela spp, Brucella spp dan Francisella spp
adalah bakteri obligat aerob yaitu bakteri yang tidak dapat tumbuh tanpa ada
oksigen. Sedangkan bakteri yang membutuhkan oksigen dalam jumlah sedikit
disebut bakteri mikroaerofilik
b)
Suhu
Bakteri pathogen biasanya tumbuh sangat baik pada suhu yang
sama dengan suhu jaringan dan organ tubuh hospes yaitu 37C walaupun
demikian suhu pembiakan biasanya berada pada rentang 35-37C. akan tetapi
beberapa bakteri memerlukan suhu tertentu untuk inkubasinya mislnya:
campylobacter jejuni (42 C), listeria monocytogenes dan yersinia enterocolitica
(dapat tumbuh pada suhu 0 C tapi suhu optimum antara 20 dan 40 C
c) pH
pH adalah pengukuran konsentrasi ion hydrogen pada
lingkungan mikroorganisme.nilai pH 7 menunjukkan kondisi netral, sedangkan pH
lebih kecil dari 7 disebut asam dan lebih besar dari 7 disebut basa. Kebanyakan
bakteri klinik menyukai kondisi pH diantara pH netral sekitar 6,7-7,5,
kebanyakan media yang diperjualbelikan telah mengandung buffer sehingga
pengecekan ph sudah tidak diperlukan lagid)
d)
dKelembaban
Air merupakan komponen yang sudah terdapat dalam media, baik
pada media padat ataupun cair tapi untuk penyimpanan dalam jangka waktu yang
lama saat pembiakan bakteri akan menyebabkan kehilangan sebagian besar kadar
air yang timbul karena proses evaporasi. Kehilangan air dari media dapat
mengganggu petumbuhan bakteri melalui dua cara yaitu:
o berkurangnya air yang merupakan komponen penting yang
akan digunakan untuk metabolisme bakteri
o dengan berkurangnya air maka konsentrasi zat terlarut dalam
media akan meningkat, dengan meningkatnya konsentrasi zat terlarut akan
meningkatkan tekanan osmotik sehingga akan menekan sel bakteri dan sel
akan lisis
Bahan-bahan pada media pertumbuhan
1. Bahan dasar
a. Air (H2O) sebagai
pelarut
b. Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media.
Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu
45⁰C.
c. Gelatin adalah polimer asam
amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis
mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.
d. Silica gel,
yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat
media.Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme
autotrof obligat.
2. Nutrisi atau zat makanan
a. Nikroba dapat menggunakan sumber N
anorganik seperti urea. Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk
metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro
seperti Fe, Mg
b. Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa
organik atau anorganik sesuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof
memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein
dan asam organik.
c. Sumber nitrogen mencakup asam amino,
protein atau senyawa bernitrogen lain dan sejumlah vitamin.
3. Bahan tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan
yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu, misalnya phenol red (indikator
asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam
organik hasil metabolisme.Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan
mikroba nontarget/kontaminan.
4. Bahan lain yang sering digunakan
dalam pembuatan media
a. Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani
atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan
kedelai.Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara
memperolehnya.
b. Meat extract.
Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak,limpa, plasenta
dan daging sapi.
c. Yeast extract. Yeast extractterbuat dari
ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino
yang lengkap & vitamin (Bcomplex).
d. Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya
pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya
digunakan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol,
dll.Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.
Klasifikasi dan fungsi media:
1. Medium berdasarkan sifat fisik
Ø Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga
setelahdingin media menjadi padat..
Ø Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar
0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media
semisolid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke
seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang.
Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue)
semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika
media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga
bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate
Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat
tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
Ø Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar,
contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth),TSB (Trypticase
Soy Broth)
2. Medium berdasarkan komposisi
Ø Medium sintesis yaitu media yang
komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose
Agar, Mac Conkey Agar.
Ø Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya
diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung
agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak
dapat mengetahui secara detail
tentang komposisi senyawa penyusunnya.
Ø Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi
yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari
bahandasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic
Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan
Ø Media
untuk isolasi
Media ini mengandung semua senyawa
esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
Ø Media selektif/penghambat bakteri tertentu yang tidak
diinginkan
Media yang selain mengandung nutrisi
juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan
pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan.
Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang
E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline.Saltbroth
yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang
toleran terhadap garam.
Ø Media
diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar
untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah,serum,
kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu.
Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi
sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya
Blood Tellurite Agar, BileAgar, Serum Agar, buffer charcoal yeast
extract agar yang mengandung L-cystein dan bahan gizi lain untuk
pertumbuhan legionella pneumophila penyebab penyakit legionnair.
Ø Media
untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk
mendiagnosis atau menganalisis metabolism suatu mikroba.Contohnya adalah Koser’s
Citrate medium, yang digunakanuntuk menguji kemampuan menggunakan asam
sitrat sebagai sumber karbon.
Ø Media
untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk
mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba.Kadang-kadang indikator ditambahkan
untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth,
Lactose Broth,Arginine Agar.
Ø Media diferensial
Media ini bertujuan untuk
mengidentifikasi mikroba dari bakteri lainnya yang sama-sama tumbuh dalam media
perbenihanberdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media
diferensial,misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih
Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna
media di sekeliling koloni, media Mac conkey agar merupakan media diferensial
dan slektif karena tidak dapat menumbuhkan bakteri gram positif.
Sterilisasi media
Bahan media yang telah dilarutkan ,
baik media cair maupun untuk meda pdat harus dilakukan terlebih dahulu
melalui proses sterilisasi menggunakan Autoclave yaitu alat untuk
mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi
menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15
Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121⁰C (250⁰F). Jadi tekanan yang bekerja ke
seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2(15 Psi = 15 pounds
per square inch).
Lama sterilisasi yang dilakukan
selama 15 menit. dan waktu harus dihitung dimulai ketika suhu telah
mencapai 121⁰ C . Setelah di autoclave media
harus mencapai suhu sekurangnya 50 ⁰C sebelum dituang ke dalam cawan petri steril (biasanya 25
ml untuk satu cawan petri) sedangkan untuk penambahan bahan-bahan seperti
darah, antibiotik, vitamin dan mineral harus ditambahkan pada saat agar
dingin sebelum dituang ke cawan petri. Untuk komponen media yang tidak tahan
panas dapat dilakukan sterilisasi dengan cara filtrasi membran
3. Pembiakan
pada media perbenihan.
Pemeriksaan
mikroskopis adalah merupakan upaya mendapatkan informasi sementara terhadap
bakteri penyebab infeksi, akan tetapi pembiakan biasanya diperlukan untuk
identifikasi secara pasti dan mengenal sifat bakteri
Tujuan
dari pembiakan bakteri adalah terdiri dari tiga tujuan utama yaitu:
1) Untuk menumbuhkan dan mengisolasi
seluruh bakteri yang ada dalam spesimen
2) Untuk penentuan jenis bakteri mana
yang pertumbuhannya paling menyerupai bakteri penyebab infeksi dan bakteri mana
yang sepertinya merupakan kontaminan
3) Untuk mendapatkan pertumbuhan
bakteri yang cukup terhadap bakteri yang sesuai secara klinik sehingga
dapat diidentifikasi sesuai sifat pertumbuhannya
Dari
sekian banyak macam media, media yang paling sering digunakan untuk
identifikasi bakteri adalah :
1. Brain-Heart infusion (BHI) / perbenihan cair.
BHI adalah media penyubur yang
berguna untuk pertumbuhan berbagai macam bakteri baik bentuk cair
maupun agar. Bahan utama terdiri dari beberapa jaringan hewan ditambah pepton,
buffer posfat, dan sedikit dekstrosa.Penambahan karbohidrat memungkinkan
bakteri dapat menggunakan langsung sebagai sumber energi. BHI biasanya
digunakan untuk media pertumbuhan spesimen darah
2. Perbenihan cair Gram
negative (GN broth).
Media selektif gram negatif digunakan untuk pembiakan
bakteri patogen saluran pencernaan ( salmonella spp dan shigella spp)
dari spesimen faeces dan rectal swab. Larutan berisi beberapa bahan aktif
termasuk natrium sitrat dan natrium deoksikolat yang menghambat pertumbuhan
organisme gram positif dan mempercepat pertumbuhan bakteri gram negatif. Untuk
mengoptimalkan selektfitas media, GN broth setelah diinkubasi 6-8
jam setelah penanaman pertama harus diisolasi ulang dan diinkubasikan kembali,
apabila melewati waktu tersebut bakteri nonenterik patogen akan tumbuh
melampaui pathogen
3.
Columbia CNA mengandung darah
Agar
Columbia CAN adalah media dasar yang mengandung tiga komponen sumber
pepton dan darah domba 5% yang tidak mengandung fibrin. Media ini juga dapat
membedakan reaksi bakteri berdasarkan kemampuan dalam menghemolisa darah.
CNA adalah merupakan antibiotic Colistin (C) dan Nalidixic acid
(NA) yang ditambahkan ke dalam media untuk menghambat mikroorganisme gram
negatif dan menumbuhkan bakteri gram positif. Contohnya untuk perbenihan
Lactobacillus spp dari specimen secret vagina, streptococcus yang menyebabkan
infeksi pada vagina dan wanita hamil.
4.
Hektoen Enteric agar (HE)
Terdiri
dari garam empedu dan zat warna indikator (brom thymol blue dan fuchsin
acid) untuk memperlambat bakteri non patogenik gram negatif batang yang
terdapat di saluran pencernaan dan memberi kesempatan salmonella dan shigella
tumbuh. Media HE juga merupakan media differensial karena bakteri non enterik
patogen akan tumbuh koloni berwarna oranye sampai merah muda kekuningan. Koloni
ini timbul dari organisme yng memiliki kemampuan menfermentasi laktosa dalam
media, kemampuan meragi menghasilkan asam yang akan menurunkan pH media dan
meyebabkan perubahan indikator bromthymol blue. Shigella tidak meragi laktosa
sehingga sehingga warna media biru kehijauan tidak berubah seperti
karakteristik media diferensial, media mengandung feri ammonium sitrat yang
mendeteksi adanya produksi gas H2S seperti salmonella spp. Dapat
terlihat melalui adanya presipitasi warna hitam pada media.
Hektoen
agar http://www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccImages/ Articleimages/Arvidson/Cultivation
Media
5.
Mac conkey agar
Mac
conkey agar adalah media selektif dan differensial yang paling sering
digunakan. Media ini terdiri dari zat warna Kristal violet untuk menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif dan jamur dan memungkinkan beberapa macam
bakteri gram negatif batang tumbuh , netral red sebagai pH indikator memberikan
warna pink sampai merah pada koloni misalnya salmonella spp.
Untuk bakteri yang tidak meragikan laktosa misalnya shigella spp
memberikan warna koloni jernih transparan
http://www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccImages/Articleimages/Arvidson/Cultivation
Media
Gambar 1. Media Mac conkey (meragi
laktosa/kiri) dan (tidak meragi laktosa/kanan)
6.
Phenyl ethyl alcohol (PEA)
PEA adalah agar darah domba yang
ditambahkan phenyl etil alcohol untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram
negatif darah domba 5% dalam PEA menyediakan kebutuhan nutrisi untuk bakteri
gram positif coccus seperti enterococcus, streptococcus dan
staphylococcus
AS-323 combination package is the
standard primary setup for anaerobic culture workup. This combination
contains a Brucella Blood Agar (BRU), Phenylethylalcohol Blood Agar (PEA), and
a Bacteroides Bile Esculin Agar (BBE)/Laked Kanamycin Vancomycin (LKV)
biplate.http://sites.google.com/site/anaerobesystemspricelist/Home/pras-combination-packages/bru-bbe-lkv-pea
7.
Perbenihan cair tioglikolat
Perbenihan
cair tioglikolat adalah media penyubur, yang mengandung bahan-bahan nutrisi
seperti casein, ragi dan ekstrak daging sapi serta vitamin untuk mempercepat
pertumbuhan , bahan lain yang ditambahkan indikator oksidasi-reduksi
(resazurin), dextrose, vitamin K1 dan hemin biasa ditambahkan pada media
modifikasi thayer martin sebagai tambahan pada media ditambahkan 0,075% untuk
mencegah pengaruh oksigen langsung terhadap larutan , bahan tambahan ini
diberikan untuk memberikan suasasana anaerob pada bagian dasar tabung
sehingga bakteri anaerob dapat tumbuh
Campylobacter
Thioglycollate Broth (CAMPY-THIO) is used as a selective growth enrichment
broth for Campylobacter species from contaminated sources
|
1
|
2
|
3
|
4
|
|
|
Oxygen relationship designation
|
STRICT
(OBLIGAobligatTE) AEROBE |
FACULTATIVE
ANAEROBE |
AEROTOLERANT
ANAEROBE |
STRICT
(OBLIGATE) ANAEROBE |
|
Aerobic respiration*
|
+
|
+
|
–
|
–
|
|
Fermentation*
|
–
|
+
|
+
|
+
|
|
Ability to grow aerobically
(oxygen tolerance) |
+
|
+
|
+
|
–
|
|
Ability to grow anaerobically
|
–
|
+
|
+
|
+
|
|
Catalase reaction
|
+
|
+
|
–
|
–
|
|
O or –
|
F
|
|||
|
Response to sodium azide in a
growth medium |
SENSITIVE
|
SENSITIVE
(under
aerobic conditions) |
RESISTANT
|
RESISTANT
|
8.
Agar darah
Gambar
2. Agar darah steril (kiri), α- hemolisa (tengah) dan β-hemolisa (kanan)
Agar darah merupakan media yang paling banyak digunakan unuk
penanaman bakteri yang sukar tumbuh karena pada agar darah domba mengandung
nutrisi yang dibutuhkan bakteri. Kemudian pula koloni yang tumbuh pada media
ini biasanya spesifik dan mudah dikenali. Media pada dasarnya terdiri
dari sumber protein(pepton), protein kedelai olahan (mengandung KH),NaCl, agar
dan darah domba 5%. Bakteri penghasil enzim ekstraseluler yang dapat
melisiskan sel darah merah domba pada agar (hemolisis). Aktifitas ini ditandai
dengan adanya zona jernih disekeliling koloni (beta hemilisis), kehijauan
(alpha hemolisis) dan untuk bakteri yang tidak menghemolisa darah tidak terjadi
perubahan pada sekeliling koloni bakteri ( gamma /non hemolisis)
9. Agar coklat dan Thayer martin
Agar coklat sama seperti agar darah
tetapi pada agar coklat darah yang digunakan di lisiskan terlebih
dahulu sebelum dimasukan ke larutan agar. Setelah darah lisis sel
eritrosit mengeluarkan bahan-bahan intraseluler seperti haemoglobin, hemin,dan
koenzim nicotinamide adenine dinucleotida (NAD) yang dapat digunakan
oleh bakteri yang sukar tumbuh. Darah yang lisis memberikan warna coklat pada
media sehingga disebut dengan agar coklat. Biasanya bakteri patogen yang
tumbuh pada media agar coklat yaitu: Neisseria meningitidis ,Haemophilus
spp (terlibat dalam infeksi saluran pernafasan dan telinga)
Agar Thayer martin
Thayer martin agar adalah media
diperkaya dan selektif untuk isolasi Neisseria gonorhoeae.Penambahan
antibiotik colistin bertujuan untuk menghambat bakteri gram negatif, vancomisin
untuk menghambat bakteri gram positif dan nistatin menghambat pertumbuhan ragi.
Antibiotik trimetropin jugsa ditambahkan untuk menghambat perumbuhan Proteus
spp, dan bakteri lainnya yang akan tumbuh menyebar di seluruh
permukaan agar dan dapat meghalangi koloni bakteri yang akan diidentifiasi Neisseria
spp. pada mredia modifkasi Thayer martin lewis, antibiotik nistatin diganti
dengan ansamisin
Gambar
3.agar coklat dan Thayer martin
colklatype: Enriched
Purpose: Cultivation of fastidious organisms such as Neisseria
or Haemophilussp.
Interpretation: Some organisms grow on chocolate
agar that do not grow on standard media
TM Type: Enriched and selective; contains three antibiotics --
colistin (kills gram-negative coliforms), vancomycin (kills gram-positives),
and nystatin (kills fungi)
Purpose: To select for fastidious organisms, such as N.
gonorrhoeae, in patient samples containing large numbers of normal flora,
such as from the female genital tract
Neisseria
gonorrhoeae (ATCC®
43069) colonies growing on Thayer Martin, Modified Agar (Cat. no. E30).
Incubated in CO2 for 48 hours at 35 deg. C.
http://www.hardydiagnostics.com/catalog2/hugo/ThayerMartinModified.htm
Isolasi
bakteri
Isolasi
atau pembiakan adalah proses menumbuhkan mikroorganisme dari tempat infeksi
(lingkungan in vivo) melalui berbagai spesimen dan menumbuhkan dalam lingkungan
tiruan di laboratorium (lingkungan invitro). Ketika bakteri tumbuh pada media,
pada umumnya populasi bakteri akan mudah diamati tanpa mikroskop karena
berada dalam jumlah yang banyak berupa koloni bakteri sehingga memungkinkan
untuk identifikasi laboratorik selanjutnya . Keberhasilan pemindahan bakteri
dari lingkungan in vivo ke in vitro memerlukan nutrisi dan lingkungan
yang dibutuhkan oleh bakteri patogen tersebut. Karena pada lingkungan in vivo
bakteri dapat menggunakan berbagai hasil metabolik dan jalur fisiologik
untuk pertumbuhan selama berada di dalam tubuh hospes kemudian secara
tiba-tiba harus dapat menyesuaikan diri dengan kondisi tiruan di laboratorium.
Dengan demikian sangatlah penting untuk menyediakan nutrisi yang dibutuhkan dan
lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan bakteri
Di dalam tubuh, populasi
mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran
berbagai macam jenis bakteri untuk memisahkan bakteri patogen perlu dilakukan
isolasi di laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur
murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan
kemampuan biokimiawinya.
Untuk memperoleh hasil yang baik
dalam pertumbuhan bakteri maka perlu cara kerja yang aseptik, dan sterilisasi
ose sebelum digunakan mengambil koloni yang dicurigai sebagai penyebab infeksi.
Teknik Pengambilan Sampel
Sebelum melakukan isolasi terlebih
dahulu dilakukan pengambilan sampel.Berikut merupakan prosedur pengambilan
sampel.
1. Sampel tanah
Jika mikroorganisme yang diinginkan
kemungkinan berada di dalam tanah, maka cara pengambilannya disesuaikan dengan
tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka
sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran..
2. Sampel air
Pengambilan sampel air bergantung
kepada keadaan air itu sendiri.Jika beerasal dari air sungai yang mengalir maka
botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air.Bila pengambilan
sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali, jika
ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu
beberapa saat dan mulut kran dibakar.
Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)
1. Teknik Preparasi Suspensi
Sampel yang telah diambil kemudian
disuspensikan dalam akuades steril.Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya
adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air
sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada
bentuk sampel :
a. Swab (ulas), dilakukan
menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas
dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya
adalah meja, batu, batang kayu dll.
Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan
kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab
akan lebih baik jika cotton bud
dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan
semisalpepton water.
b. Rinse (bilas) ditujukan
untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang
luas tapi relative berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan
prosedur kerja dengan mencelupkan
sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun
diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat
dalam beaker glass.
c. Maseration (pengancuran),
sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga
mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan
ke dalam air. Contoh sampelnya antar alain bakso, biji, buah dll. Perbandingan
antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah
1 : 9 (w/v). Untukk sampel dari tanh
tak perlu dimaserasi
2. Teknik Pengenceran Bertingkat
Tujuan dari pengenceran bertingkat
yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam
cairan.Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada
perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk
sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya
mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.
Cara Kerja :
a.
Sampel yang mengandung bakteri
dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan
berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang
digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1.
Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar
dapat dilihat pada gambar disamping)
b.
Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung
ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung
pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet
ukur yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran
digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak
perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama.
3. Teknik Penanaman
a.
Teknik penanaman dari suspensi
Teknik penanaman ini merupakan
lajutan dari pengenceran bertingkat.Pengambilan suspensi dapat diambil dari
pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni
tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.
1)
Spread Plate (agar tabur ulas)
Spread plate adalah teknik menanam dengan
menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun
prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut :
·
Ambil suspensi cairan senamyak 0,1
ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah
memadat.
·
Batang L atau batang drugal diambil
kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian
didinginkan dan ditunggu beberapa detik. Kemudian disebarkan dengan menggosokan
nya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih
efektif bila cawan ikut diputar.
·
Hal yang perlu diingat bahwa batang
L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena
panas.
2)
Pour Plate (agar tuang)
Teknik ini memerlukan agar yang
belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi
bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat.
Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja
melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh
dipermukaan agar yang kaya O2dan ada yang tumbuh di dalam agar yang
tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang
dilakukan adalah sebagai berikut :
·
Siapkan cawan steril, tabung
pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45oC)
·
Teteskan 1 ml secara
aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong
·
Tuangkan media yang masih cair ke
cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media,
kemudian diinkubasi.
Alasan diteteskannya bakteri
sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml
untuk pour plate karena spread plate
ditujukan untuk menumbuhkan dipermu kaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan
ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari
pada spread plate.
b.
Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan untuk mengisolasi
mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru.
1) Goresan Sinambung
Cara kerja :
·
Sentuhkan inokulum loop pada koloni
dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar.
·
Jangan pijarkan loop, lalu putar
cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis. Goresan sinambung umumnya
digunakan bukan untuk mendapatkan koloni
tunggal, melainkan untuk peremajaan
ke cawan atau medium baru.
2) Goresan T
Cara kerja :
·
Bagi cawan menjadi 3 bagian
menggunakan spidol marker
·
Inokulasi daerah 1 dengan streak
zig-zag
·
Panaskan jarum inokulan dan tunggu
dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada
gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna
·
Lakukan hal yang sama pada daerah 3
3) Goresan Kuadran (Streak quadrant)
Cara kerja :
Hampir sama dengan goresan T, namun
berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan
awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.Goresan selanjutnya
dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin
sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.
Inkubasi
Metode-metode
yang digunakan untuk mengoptimalkan kondisi inkubasi :
inkubasi dilakukan pada suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri (35⁰C-37⁰C) dan kelembaban udara yang
mengandung CO2 sekitar 3-5%
untuk pertumbuhan bakteri yang
memerlukan CO2 lebih banyak diperlukan inkubasi pada tempat khusus yang
mengandung CO2 (tablet natrium bikarbonat dengan kelembaban dan penutupan yang
sangat erat akan menghasilkan CO2 yang cukup , sebagai alternatif dapat
juga dilakukan inkubasi pada sungkup lilin yang dapat menghasilkan CO2 3%
Identifikasi bakteri
Setelah isolasi, bakteri yang tumbuh
pada media perbenihan dilakukan identifikasi dengan tahapan sebagai berikut:
1) Evaluasi morfologi koloni
Evaluasi
morfologi koloni dengan memperhatikan warna koloni, bentuk koloni (seperti
titik, bundar, berfilamen,atau tidak beraturan), elevasi koloni (cembung,
cekung, datar), serta batas koloni (halus atau tidak beraturan)
2) Pemeriksaan mikroskopis
Pemeriksaan
mikroskopis dengan cara pewarnaan gram dengan melihat diferensiasi (termasuk
bakteri gram positif atau negatif), bentuk (coccus, batang, koma, atau
pleimorf), susunan (sendiri-sendiri, diplo, berantai, atau seperti anggur)
3) Uji biokimia
Uji
biokimia dilakukan untuk melihat karakteristik bakteri melalui reaksi
biokimia, yang biasa dilakukan diantaranya.
a. TSIA (Tripel Sugar Iron Agar)
Digunakan
untuk identifikasi bakteri gram negatif batang, untuk melihat kemampuan meragi
glukosa dan sukrosa atau laktosa. Contohnya hasil untuk Escherichia coli
(acid/acid), Salmonella thypii (alkali/acid+H2S) sedangkan Pseudomonas
aerugenosa (alkali/alkali)
Gambar 5.
Hasil uji pada TSIA
b. Fermentasi karbohidrat/gula-gula
Gambar 6.
Hasil positif (tabung berwarna kuning) meragi gula
http://www.blinn.edu/natscience/phillips/Micro%20Pictures.htm
c. MR/VP (methyl red /voges proskauer)
Uji ini
dilakukan untuk menentukan organisme yang memproduksi dan mengelola asam dan
produk-produknya dari hasil fermentasi glukosa, memperlihatkan kemampuan sistem
buffer dan menentukan organism yang menghasilkan prosuk netral (asetil metal
karbinol atau aseton) dari hasil fermentasi glukosa
d. SIM (sulfur, indol, motility)
Uji ini
untuk mengetahui pergerakkan bakteri, produksi indol dan pembentukkan gas H2S
e. Simon citrate
Uji ini dilakukan untuk menentukkan
bakteri yang menggunakan sitrat sebagai sumber karbon
Gambar 9.
Hasil uji simon citrate (positif warna biru)
f. Urease
Urease menghidrolisis substrat urea
menjadi ammonia, air dan karbondioksida. Adanya enzim urease ditentukan dengan
inokulasi organism pada media cair atau agar yang mengandung urea sebagai
sumber utama karbon dan mendeteksi adanya ammonia. Ammonia akan meningkatkan pH
media yang telah mengandung pH indikator sehingga perubahan pH
sebagai hasil produksi ammonia dapat dilihat dari perubahan warna media dari
kuning menjadi pink. Ters urease membantu dalam identifikasi beberapa spesies Enterobacteriaceae
seperti Proteus spp, Corynebacterium urealyticum dan Helicobacter
pylori
Hasil
tes urease
rapid
urea testhttp://en.wikipedia.org/wiki/Rapid_urease_test
The test
is performed at the time of gastroscopy. A biopsy
of mucosa is taken from the antrum
of the stomach, and is placed into a medium
containing urea and an indicator such as phenol red. The urease produced by H. pylori hydrolyzes urea to
ammonia, which raises the pH
of the medium, and changes the color of the specimen from yellow (NEGATIVE) to
red (POSITIVE).
g. Tes indol
Bakteri yang memproduksi enzim tryptophanase mampu menguraikan asam amino
tryptophan menjadi asam piruvat, ammonia dan indol.Indol dideteksi dengan
kombinasi indicator aldehid (1% paradimetilaminosinamaldehid) yang
mengahasilkan warna merah ungu. Tes ini sangat berguna terutama untuk
identifikasi Escherichia coli .
http://biochemicaltestsproject.blogspot.com/2009/06/indole-test.html
h. Tes oksidase
Paper strips for testing the oxidase
reaction, contains tetramethyl-p-phenylenediamine for a more sensitive test,
simply place a drop of water on the strip, then rub on bacteria, positives turn
dark purple within 15 seconds,
FITRAH LUTFIA MAHARANI
X-ANALIS KESEHATAN
Tidak ada komentar:
Posting Komentar